天然催化劑——酶，對于維持生命活動至關重要， 比如參與DNA復制與轉錄、蛋白質合成、信號轉導等。因其具備高效性、專一性和環境友好等優勢，也被廣泛應用于醫藥、食品、能源、環保等多個領域。但是，天然酶的性質往往難以直接滿足工業應用需求，因此，酶工程應運而生，旨在通過修飾、優化或設計酶來提升其在各種應用中的性能。

圖1：主要的酶工程策略

然而，盡管酶工程前景廣闊，但在實際應用中仍面臨諸多挑戰和瓶頸，比如：

1.體外表達和純化難：由于細胞膜的存在、內部代謝的復雜性、反應條件難以精確控制以及可能的代謝產物毒性，許多需要進行工程改造的酶在細胞內表達效率低下，且純化過程困難。

2.大規模文庫篩選效率低：定向進化需要從龐大的突變體庫中篩選出具有特定改良性能的酶，傳統的篩選方法無法高效的從龐大的遺傳多樣性庫中識別出最合適的變異；

3.預測性設計能力有限：由于蛋白質序列-功能關系的復雜性，精確預測突變對酶性能的影響仍然具有挑戰性。

無細胞蛋白表達技術（CFPS）的出現，為酶工程領域提供了全新的解決方案，重塑了酶工程的研究范式和應用前景。該技術打破了細胞的“束縛"，無需維持細胞活力，大大提高了酶制備的靈活性和效率，從而規避了上述傳統表達系統的諸多限制。

CFPS技術并非簡單地將細胞裂解后提取蛋白，而是一種高度可控、模塊化、開放式的體外生物合成平臺。它通過保留細胞內轉錄與翻譯的核心機器（如核糖體、tRNA、能量再生系統等），在試管或微孔板中直接利用DNA模板合成目標蛋白。由于無需維持細胞活性，CFPS擺脫了生命系統的諸多約束，為酶的設計、篩選與優化提供了未有的自由度。其優勢包括：

1.開放反應體系；2.操作簡便靈活；3.表達快速高效易純化；4.可與自動化設備結合等。

圖2：無細胞酶工程示意圖

• 高通量篩選與定向進化

• 毒性酶的高效表達

傳統酶工程中，毒性酶的表達是一大難題，因為這些酶會對宿主細胞產生毒性甚至致死效應，導致無法獲得足夠產量。CFPS技術因無完整細胞結構，可安全表達此類“危險"蛋白。

• 加速酶設計與優化

• 非天然酶設計

• 多酶級聯反應的構建

CFPS技術通過縮短反應時間和加速代謝途徑優化，可以很容易地擴展為無細胞代謝工程（CFME）的多路復用形式。與體內系統相比，CFME具有反應速率更快、對底物和產物耐受性更高以及易于分離產物的優點。該技術允許科研人員構建多酶級聯反應，將各種酶通過物理或功能連接聚集在一起，形成復雜的代謝網絡，合成高附加值生物產品。

（相關文章鏈接：助力合成生物學創新|無細胞蛋白合成系統在酶促過程中的應用）

圖3：采用純化酶(a)或細胞提取物(b)進行的無細胞代謝工程

酶工程是連接基礎生物學與產業應用的橋梁，而無細胞蛋白表達技術正在重塑酶工程的研究范式，其開放性、靈活性和高效性為解決傳統酶工程面臨的挑戰提供了全新解決方案。從難表達酶的高效合成，到翻譯后修飾的精準調控，再到代謝途徑的理性設計和非天然酶的功能拓展，這項技術展現出廣闊的應用前景。

未來，CFPS有望與AI驅動的酶設計、自動化機器人平臺深度融合，構建“設計—合成—測試—學習"（Design-Build-Test-Learn）閉環，極大加速新型工業酶的開發進程。隨著技術的不斷成熟，CFPS技術有望在以下領域發揮更大作用：

CFPS技術或將重塑整個生物制造生態，推動生物制造、醫藥開發、環境治理等領域的創新發展。未來，我們有理由期待這一技術為綠色生物制造和可持續發展貢獻更多力量，開啟酶工程研究的新篇章。

珀羅汀生物作為一家專業的無細胞蛋白表達生物技術公司，已依托自主研發的 CFPS 技術平臺，搭建起高通量自動化蛋白表達工作站，可高效完成難表達酶、膜蛋白等的快速合成，助力酶開發、藥物靶點研究等場景的效率升級。